PRÁCTICA 5.                                                                                     

TINCIÓN DE GRAM

OBJETIVO: realizar una tinción sobre las bacterias para visualizarlas con el microscopio.

FUNDAMENTO: Diferenciar mediante la tinción entre las paredes celulares de las bacterias Gram negativa y Gram negativa. Mientras que la pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa depeptidoglicano, además de dos clases de ácidos teicoicos, la capa de peptidoglicano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (descomposición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.

MATERIALES Y REACTIVOS:Cubeta de cristal,Puente de tinción, Mechero bunsen , Vaso de precipitado, Pipeta Pasteur x3, Asa de siembra, Portaobjetos , Agua destilada, Papel secante, Lugol, Acetona (30% acetona y 70% Etanol), Safranina, Cristal violeta.

PROCEDIMIENTOS: añadiremos sobre el porta objetos una gota de solución salina,en condiciones de esterilidad con una asa de siembra cogeremos bacterias de un cultivo solido y lo esparceremos sobre la gota de solución salina, dejamos secar y una vez seco pasamos 4-5 veces sobre la llama del mechero bunsen para secar bien las bacterias. A continuación colocaremos el porta objetos sobre el puente de tinción previamente colocado sobre la cubeta de cristal y con ayuda de una pipeta echaremos un par de gotas de cristal violeta sobre las bacterias y dejaremos actuar durante un minuto, ahora con agua destilada y una pipeta pasteur, enjuagaremos unas 3veces o mas hasta eliminar por completo, el cristal violeta sirve para dar color a las Gram +. Ahora repetiremos el mismo proceso con lugol que fijara el colorante a las bacterias, tras un minuto enjuagaremos con la pipeta, ahora alcohol-acetona durante unos 40 segundos y limpiamos y para terminar safranina que da color a las Gram - un minuto también y enjuagar. Eliminamos toda el agua dando golpecitos suaves sobre la mesa y dejamos que seque.
 Medidas de prevención: Nunca utilizar acetona pura porque eliminaría completamente la tinción
Usar guantes a la hora de realizar la tinción ya que los indicadores son muy fuertes y tarda en eliminarse el color de la piel.

RESULTADOS: presencia de bacilos Gram + en color negro.

MICROSCOPIO:Es un aparato de observación microscópica por transparencia el cual usamos cuando el número de aumentos que necesitamos es superior a 30.
Consta de:
• OCULAR: Es de tipo binocular y presenta diferentes aumentos en el ocular izquierdo para poder ajustarse mejor a cada persona según si necesitamos gafas o no.
• TUBO ÓPTICO: Entre el ocular y el revólver portaobjetos.
• COLUMNA: Donde se sitúan los demás objetos del microscopio, está situado sobre el píe.
• REVÓLVER PORTAOBJETOS: Es aquí donde se sitúan los objetivos de diferentes aumentos.
• OBJETIVOS: Nuestro microscopio tiene aumentos de 4 (rojo), 10 (amarillo), 40 (azul) y 100 (blanco). Para saber el número de aumentos con el que estamos viendo se multiplica el número de aumentos del ocular  por el del objetivo.
• PINZAS: Se utilizan para sujetar la muestra, ubicadas en la platina.
• PLATINA: Sobre el foco de iluminación y del diafragma, pieza rectangular con un agujero en medio por el que pasa la luz. Puede moverse vertical y horizontalmente.
• DIAFRAGMA: Entre el puente de iluminación y la platina, nos permite regular la intensidad de la luz.
• PIE: Base del microscopio

Utilización del microscopio:
Se debe empezar con el menor número de aumentos y con una luz tenue para no lastimarnos los ojos.
Colocamos sobre la platina el portaobjetos con la preparación microscópica sujetándola con las pinzas.
Los objetivos nunca deben tocar el portaobjetos.
A continuación jugamos con los tornillos macrométrico y micrométrico hasta enfocar la preparación con la máxima precisión posible.
Aceite de inmersión:
El objetivo de la lente con resolución 100 (blanco), está diseñado para ser usado con el aceite de inmersión que debe aplicarse entre la lente frontal y el cubreobjetos .
El uso de este aceite permite enfocar objetos muy pequeños como bacterias ya que evita que la luz se desvíe concentrándola hacia la muestra con la formación de una columna entre la lente y el cubreobjetos.
Una vez hemos terminado deberemos limpiar con un trapo suave la lente, apagar la luz del microscopio y desenchufarlo.